动物原代细胞养殖

动物原代细胞培养的操作步骤

动物原代细胞培养是指将动物的各种组织从机体中取出，经过处理使其分散成单个细胞，然后在适宜的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。以下是动物原代细胞培养的具体操作步骤：

1. 取材- 颈椎脱臼法处死小鼠：将小鼠处死后，放在100ml的烧杯中用70%乙醇消毒3分钟。

• 打开腹腔：将小鼠置超净工作台上，打开腹腔，取出肾、肝、脾（任意一种脏器）。

2. 漂洗- 清洗组织：在盛有PBS缓冲液的平皿中洗涤数次，剔除包膜、结缔组织，将剔除后的脏器放入另一个盛有PBS的平皿中。

3. 剪切- 剪成1mm³的组织块：将肾、肝、脾剪成1mm³（剪成肉末状）大小的组织块，再次清洗，洗去残留的血细胞，以备消化。

4. 消化- 加入胰蛋白酶溶液：在50ml离心筒中加入 %胰蛋白酶溶液25ml，在温暖的环境中或置于37℃水浴摇床中轻轻摇动15分钟，转速约为180r/min。

• 离心和灭活：让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入1ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶。

• 重复消化：在离心管中残留未消化组织块中再次加入胰蛋白酶进行消化，重复上述步骤。

5. 制备单细胞悬液- 离心和洗涤：将混合的细胞悬液离心，1200rpm，5分钟，弃上清。将沉淀用新鲜的无菌PBS重悬，再1000-1200rpm，5分钟离心。用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止，然后再按照第一步进行离心，离心后弃去上清液。

• 吹打和悬浮：将沉淀用少量细胞培养液反复吹打，制成细胞悬液。

6. 接种- 接种到细胞培养瓶中：将细胞悬液接种到细胞培养瓶中。

• 过滤和调整体积：用滤器过滤细胞培养液再悬沉淀，并使终体积为20ml。

7. 培养- 标记和培养：在培养瓶外做好标记（标明所培养细胞的名称和时间），置于CO₂的孵箱中培养，72小时后即可观察。

动物原代细胞培养的注意事项- 无菌操作：整个操作过程需要在无菌条件下进行，确保不引入污染。

• 培养条件：不同的细胞类型可能需要特定的培养基和培养条件，需根据具体情况进行调整。

• 细胞传代：当细胞生长到一定程度时，需要进行传代培养，以维持细胞的生长和增殖。

动物原代细胞培养是一项复杂但重要的技术，广泛应用于生物学、医学等领域。通过严格的无菌操作和适当的培养条件，可以成功地从动物组织中分离和培养出原代细胞，为进一步的研究提供基础。